В останні роки, мабуть, жоден інший білок не досліджувався так інтенсивно, як p53. За понад чверть століття з моменту його відкриття цьому білку присвячено десятки тисяч наукових робіт, і їх кількість постійно зростає. Така увага зумовлена передусім ключовою роллю p53 у захисті організму від онкопатологій – одного з найсерйозніших викликів сучасної медицини.
Вивчення механізмів дії p53 відбувалося паралельно з дослідженням фундаментальних процесів клітинної біології: розпізнавання та передачі внутрішньоклітинних сигналів, репарації ДНК, регуляції клітинного циклу й апоптозу, координації метаболічних процесів і міжклітинної взаємодії. Вражає те, що функції p53 виявилися пов’язаними практично з кожним із цих процесів, формуючи складну та інтегровану систему клітинного контролю.
Білок p53 формує складну регуляторну мережу, що координує ключові процеси життєдіяльності клітини. Він не лише отримує сигнали про зміни від нормальних параметрів у різних клітинних процесах, а й запускає відповідні реакції, які забезпечують їх корекцію та визначають подальший життєвий цикл клітини. У цьому сенсі роль p53 часто порівнюють із «диригентом оркестру»: він контролює узгоджене виконання еволюційно сформованих програм функціонування клітин за різних умов.
Охоронець ДНК: історія білка р53
У середині ХХ століття сформувалося уявлення про рак як генетичне захворювання, пов’язане з порушенням генів, що контролюють клітинний поділ. Під час досліджень вірусного канцерогенезу було введено поняття онкогенів – генів-регуляторів, зміна активності яких може призводити до пухлинної трансформації клітин. У 1970-х роках розвиток молекулярно-біологічних методів дав змогу детальніше досліджувати механізми такої трансформації.
Одним із ключових об’єктів дослідження став ДНК-вірус SV40, який легко викликав трансформацію клітин у культурі. Було встановлено, що для цього процесу достатньо експресії одного вірусного білка – великого Т-антигену. У 1979 році з’явилися дані про те, що цей білок у трансформованих клітинах міцно зв’язується з клітинним білком із молекулярною масою приблизно 53 кДа. Спочатку його назвали клітинним Т-антигеном, але згодом він отримав назву p53.
Подальші дослідження показали, що цей білок накопичується не лише у клітинах, трансформованих вірусом, але й у пухлинних клітинах людини, а також викликає появу специфічних антитіл у крові онкологічних пацієнтів. Це дозволило розглядати p53 як маркер пухлинних клітин.
Перші уявлення про його функцію були отримані в експериментах, де антитіла до p53 вводили в культивовані клітини. У результаті спостерігалася затримка переходу клітин у S-фазу клітинного циклу, що свідчило про участь p53 у регуляції клітинного поділу. Згодом було клоновано кДНК p53, а пізніше й сам ген, що відкрило нові можливості для молекулярно-генетичних досліджень. Спочатку вважалося, що p53 може діяти як онкоген, оскільки його експресія у клітинах разом із онкогеном Ras сприяла їх трансформації, а штучні мутації в гені p53 посилювали цей ефект.
Проте у 1989 році відбулося важливе відкриття: з’ясувалося, що раніше досліджувані варіанти гена p53 містили точкові мутації. Саме ці «мутантні форми» й проявляли онкогенні властивості. Натомість нормальний p53, виділений із здорових клітин, пригнічував клітинний поділ і гальмував розвиток пухлин. Таким чином, було встановлено, що p53 є геном-супресором пухлин, а не онкогеном.
Додатковим підтвердженням цієї ролі стали дослідження на генетично модифікованих мишах, у яких ген p53 був видалений. Спочатку такі тварини розвивалися нормально, однак уже у віці 2–3 місяців у них різко зростала схильність до злоякісних пухлин. До дев’яти місяців більшість таких мишей гинули від лімфом або інших онкологічних захворювань.
Клітини, отримані від ембріонів цих мишей, характеризувалися високою хромосомною нестабільністю: у них швидко накопичувалися клітини з аномальною кількістю хромосом – анеуплоїдні та поліплоїдні. Саме така геномна нестабільність вважається одним із ключових механізмів розвитку пухлин.
Білок p53 відіграє надзвичайно важливу захисну роль в організмі. Його нормальне функціонування значно зменшує ймовірність накопичення аномальних клітин із різними змінами геному, зокрема такими, що можуть сприяти пухлинній трансформації клітин або прогресуванню вже сформованих пухлинних клонів. Саме тому білок p53 часто називають «охоронцем геному».
Захисна дія цього білка пов’язана з його здатністю регулювати активність чисельної кількості генів, продукти яких виконують важливі фізіологічні функції.
По-перше, p53 стимулює синтез білків, що беруть участь у нейтралізації активних форм кисню. Завдяки цьому клітини краще захищені від оксидативного стресу, який може пошкоджувати ДНК та спричиняти мутації.
По-друге, діючи як транскрипційний фактор і взаємодіючи з іншими білками, p53 активує системи репарації пошкодженої ДНК. Це допомагає клітинам відновлювати генетичний матеріал і підтримувати стабільність геному.
По-третє, p53 бере участь у контролі клітинного поділу. Він запобігає порушенням у роботі центросом і появі багатополюсних мітозів, що забезпечує правильний розподіл хромосом між дочірніми клітинами. Нарешті, під дією різних зовнішніх факторів або внутрішньоклітинного стресу p53 зазнає посттрансляційних модифікацій, у результаті чого він набуває так званої «стресової» форми, стає більш стабільним і активним та починає сильніше впливати на гени, що зупиняють клітинний цикл або запускають апоптоз – програмовану загибель клітини.
Крім того, стабілізований p53 може переміщуватися до мітохондрій, підвищуючи проникність їхніх мембран і сприяючи вивільненню молекул, які запускають апоптоз, зокрема цитохрому С. Таким чином, клітини, в яких виникли небезпечні генетичні зміни, або припиняють поділ для відновлення ДНК, або самознищуються, що запобігає розвитку пухлин.
В ембріональних стовбурових клітинах активований p53 також пригнічує ген NANOG, унаслідок чого клітини втрачають здатність до самопідтримання та подальшої диференціації.
Коли активується білок p53, клітина може відреагувати двома способами: тимчасово зупинити поділ або запустити програмовану загибель клітини. Те, який саме механізм буде обраний, залежить від багатьох факторів. По-перше, це тип клітини. Наприклад, у фібробластах p53 зазвичай викликає зупинку клітинного циклу, тоді як у лімфоцитах частіше запускається апоптоз. По-друге, важливу роль відіграє стан інших сигнальних шляхів клітини. Якщо порушена робота білка pRb або надмірно активні регуляторні білки Myc чи E2F, клітина частіше переходить до апоптозу замість простої зупинки поділу. По-третє, значення має рівень активації p53: чим більше цього білка накопичується у клітині, тим вища ймовірність запуску апоптозу.
***
ЦЕ ЦІКАВО!!!
У слонів, попри їхні солідні розміри й значну тривалість життя, онкологія спричиняє близько 5 % усіх смертей. Для порівняння, у людей цей показник сягає аж 25 відсотків. Чому слони мають цю перевагу? Як встановили вчені, висока опірність слонів до раку пов'язана з тим, що ці тварини мають аж 40 копій гена р53 (у людини наявні лише 2 копії).
Білок, кодований геном р53, активується у випадку генетичної помилки під час ділення клітини. Водночас ген р53 дезактивується іншим білком, MDM2. Це може призвести до зниження рівня р53 саме тоді, коли той мав би спрацювати. Як з'ясували вчені, у слонів кожна зі 40 копій гена P53 відрізняється від інших – тож кожна взаємодіє з MDM2 по-різному. Білки, кодовані різними генами р53, набагато важче «вимкнути» шляхом описаного контакту з білком MDM2. Отже, механізм захисту клітин, контрольований геном р53, у слонів активніший і ефективніший, ніж у людей.
***
Ще одним фактором є різні ізоформи p53. Вони можуть по-різному впливати на гени, які відповідають за загибель клітини, тому деякі з них сильніше стимулюють апоптоз. Крім того, на рішення клітини впливають додаткові білки-кофактори, які допомагають p53 активувати гени, що запускають програмовану смерть клітини.
Важливу роль відіграють і хімічні модифікації самого p53. Наприклад, певні зміни в його структурі можуть активувати ген p21, що веде до зупинки клітинного циклу. Якщо ж до цих змін додається інша модифікація, активується ген p53AIP1, і клітина переходить до апоптозу. Ймовірність таких змін зростає, коли пошкодження ДНК є більш серйозними.
Функції p53 не обмежуються лише контролем геному та знищенням небезпечних клітин. Цей білок також перешкоджає «безсмертю» клітин – здатності ділитися необмежену кількість разів. Він пригнічує ген, який кодує важливу частину ферменту теломерази, що відповідає за подовження теломер і безперервний поділ клітин.
Крім того, p53 може гальмувати утворення нових кровоносних судин у пухлинах. Це важливо, адже пухлинні клітини потребують постійного постачання кисню та поживних речовин для росту.
Ще одна функція p53 – регуляція клітинного метаболізму. Він пригнічує процес гліколізу, який часто посилюється у пухлинних клітинах і допомагає їм виживати навіть у умовах нестачі кисню. Саме тому втрата функції p53 значно підвищує ризик розвитку раку.
Білок p53 та старіння
Будучи центром контролю правильності виконання генетичних програм, p53 неминуче пов’язаний і з процесами старіння організму. Водночас старіння слід відрізняти від захворювань, які часто супроводжують літній вік. Досі остаточно не з’ясовано, чи є старіння безпосередньо запрограмованим біологічним процесом, чи воно прискорюється після того, як з віком послаблюється дія програм регенерації та репарації організму.
Значні відмінності у тривалості життя між різними видами свідчать про існування генетичної зумовленості довголіття. Водночас навіть у межах одного виду тривалість життя може значно відрізнятися, і є переконливі докази спадковості схильності до довголіття. Тому спадковість можна розглядати як один із ключових факторів, що визначають тривалість життя.
Другим важливим фактором є спосіб життя, адже численні дослідження показують його істотний вплив на тривалість життя.
Існують також переконливі дані про роль окиснювальних процесів у старінні. Організм має потужні антиоксидантні системи, які захищають клітини від пошкоджень та забезпечують швидку репарацію. Проте з віком ефективність цих механізмів поступово знижується. Уявлення про роль p53 у старінні залишаються суперечливими. Генетичні експерименти на мишах дали неоднозначні результати. Наприклад, досліджувати старіння у мишей без гена p53 практично неможливо, оскільки такі тварини зазвичай не доживають навіть до одного року, помираючи від злоякісних лімфом. Якщо ж у мишей активувати ген p53 лише частково, частота спонтанних пухлин зменшується, але при цьому спостерігається передчасне старіння. Водночас введення додаткової копії нормального гена p53 або зниження експресії гена Mdm2 забезпечує захист від раку без скорочення тривалості життя.
У людей також існує генетичний поліморфізм гена p53 за 72-ю амінокислотою. Варіант Arg72 забезпечує кращий захист від раку, тоді як носії варіанта Pro72 мають дещо нижчу протиракову захисну здатність, але при цьому можуть характеризуватися більшою середньою тривалістю життя. Це свідчить про певний біологічний парадокс: посилений захист від раку може супроводжуватися прискоренням процесів старіння.
Важливо враховувати, що різні рівні активності p53 мають різні наслідки. Помірний рівень p53 сприяє підтриманню балансу клітинних процесів, зменшує ризик мутацій і підвищує ефективність репарації ДНК. Це корисно як для профілактики раку, так і для уповільнення старіння. Вважається, що продовження життя при обмеженні калорійності харчування також частково пов’язане з активністю p53. За нормального рівня цього білка пригнічується сигнальний шлях IGF-mTOR, а дефіцит глюкози стимулює активацію p53 через фермент AMPK. Важливу роль може відігравати й аутофагія — процес «очищення» клітини від пошкоджених компонентів, у якому бере участь контрольований p53 ген DRAM.
Під час аутофагії клітини фактично омолоджують свою цитоплазму: у лізосомах руйнуються пошкоджені білки, що накопичуються з віком (наприклад, ліпофусцин), а також видаляються дефектні мітохондрії, які виробляють надлишок кисневих радикалів. При помірній активності p53 його антиоксидантна функція додатково знижує ризик накопичення мутацій і захищає організм від передчасного виснаження ресурсів, оскільки високий рівень кисневих радикалів прискорює вкорочення теломер. Таким чином, за помірного способу життя активність гена p53 одночасно спрямована і проти розвитку раку, і проти передчасного старіння.
Однак існує й інший сценарій. У відповідь на сильні стреси, інтоксикації, опромінення, інфекції, запалення, надлишок калорій або метаболічні порушення (наприклад, при цукровому діабеті) p53 активується значно сильніше. У цьому випадку він запускає апоптоз найбільш пошкоджених клітин. Такий процес супроводжується масовим утворенням кисневих радикалів, які впливають не лише на клітини, що гинуть, а й на навколишні тканини. Це може призводити до окиснення ДНК, накопичення мутацій, змін міжклітинного матриксу, розвитку фіброзу та інших тканинних патологій.
Хронічні запалення підтримують постійний оксидативний стрес, що прискорює скорочення теломер і виснаження регенеративних можливостей тканин. У результаті може виникати так зване локальне старіння тканин, яке лежить в основі багатьох нейродегенеративних захворювань, а також сприяє розвитку емфіземи легень, патологій нирок та інших хвороб.
Лабораторна діагностика білка p53
Лабораторна діагностика p53 базується на комплексному підході, який включає морфологічні, імуногістохімічні та молекулярно-генетичні методи.
Найбільш доступним і широко застосовуваним методом є імуногістохімічне дослідження (ІГХ), що дозволяє визначити рівень експресії білка p53 безпосередньо у тканинних зразках (біопсійний або операційний матеріал). У нормальних клітинах p53 має дуже короткий період напівжиття і, зазвичай, не виявляється або визначається у мінімальній кількості. Натомість мутантні форми білка є стабільнішими, накопичуються в ядрі клітин і дають інтенсивну позитивну реакцію при ІГХ. Типовим є ядерне забарвлення пухлинних клітин. Водночас слід враховувати, що не всі мутації TP53 супроводжуються накопиченням білка, тому негативний результат ІГХ не виключає наявності генетичних змін.
Для уточнення характеру порушень застосовуються молекулярно-генетичні методи. Найбільш інформативним є секвенування гена TP53 (зокрема, методом NGS – next-generation sequencing), яке дозволяє ідентифікувати точкові мутації, делеції або інсерції. Також використовується полімеразна ланцюгова реакція для ампліфікації окремих ділянок гена з подальшим аналізом. Ці методи дають можливість не лише підтвердити наявність мутацій, але й визначити їх тип, що має важливе прогностичне значення, оскільки різні мутації можуть по-різному впливати на функцію білка.
У деяких випадках застосовуються методи оцінки функціональної активності p53, які дозволяють визначити здатність білка виконувати свої регуляторні функції. Проте такі методи використовуються переважно в наукових дослідженнях.
Додатковим напрямком є визначення p53 або антитіл до нього у сироватці крові за допомогою імуноферментного аналізу. Наявність антитіл до p53 може свідчити про імунну відповідь організму на пухлинні клітини, що експресують мутантний білок. Однак цей підхід має обмежену чутливість і специфічність, тому використовується як допоміжний.
У клінічній практиці оцінка статусу p53 має значення не лише для діагностики, але й для прогнозу перебігу захворювання. Наявність мутацій TP53 часто асоціюється з більш агресивним перебігом пухлини, резистентністю до терапії та гіршим прогнозом. Крім того, визначення статусу p53 може бути важливим при виборі терапевтичної тактики, зокрема у контексті персоналізованої медицини.
Білок p53 – це не просто одна з багатьох молекул у клітині, а справжній охоронець генетичної стабільності. Він уважно стежить за станом ДНК, вчасно зупиняє поділ пошкоджених клітин і, коли потрібно, запускає механізм їх знищення. Завдяки цьому p53 відіграє ключову роль у захисті організму від розвитку раку. Дослідження цього білка відкриває нові горизонти для медицини.
Література:
Choi S., Chen M., Cryns V.L. et al. (2019) A nuclear phosphoinositide kinase complex regulates p53. Nature Cell Biology, Mar. 18. DOI: 10.1038/s41556-019-0297-2
Ananiev J. et al. (2007) P53 – the Guardian of genome. Acta Medica Bulgarica. 38(2): 72-82.
Paddock C. (2019) How destroying a tumor promoter could lead to new cancer treatments. Medical News Today, Mar. 19.